KEGG富集条形图绘制全攻略：从富集表到R语言/TBtools出图

做转录组、蛋白组或者代谢组的同学，应该都有过这种经历：分析流程跑完，得到一张KEGG富集表，上千个通路名排在面前，然后被组会问到“你这张表怎么变成图”。KEGG条形图就是解决这个问题的最常见方案——把富集到的通路名称、差异基因富集数目、显著性P值这三个核心信息，压缩成一张几秒钟就能看懂的横向条形图，直接放进论文结果部分。它是组学文章里出场率最高的图之一，适合所有需要展示蛋白功能、代谢通路或疾病机制的研究场景。这篇文章我会从KEGG富集分析结果到底怎么看讲起，结合TBtools和R语言两种常用出图方式，把数据筛选、排序、配色、避坑一次讲清楚。

1. 从富集表格到图形的设计思路

1.1 KEGG条形图到底在画什么

KEGG是一个通路数据库，核心思路是根据测序得到的基因列表，去匹配数据库中已知的通路信息，判断这些差异基因集中参与哪些生物学过程，这个分析过程叫“富集分析”。富集分析的输出通常是表格，表格里每一行是一条通路，每一列是通路名、基因数、显著性等指标。条形图要做的，就是把这个表格里的关键维度转成图形：通路名称沿纵轴排列，条形长度代表富集到的基因数目或者比例，颜色深浅代表显著性P值。

按我的习惯，这里的“条形图”一般指横向条形图。原因很简单，KEGG通路名字都很长，比如“PI3K-Akt signaling pathway”这一串，放在横轴作分类标签根本排不开，旋转成竖排又不方便审稿人阅读。横向排布时，通路名在左侧纵向展开，条形向右延伸，版面利用率最高。x轴可以选Count（富集到该通路的基因数目），也可以选GeneRatio（富集基因数占输入基因总数的比例）；颜色则固定映射p.adjust一类显著性指标。一张图同时承载三个维度的信息，这才是富集条形图和普通柱状图的本质区别。

1.2 为什么优先选条形图而不是气泡图

很多新手会问，KEGG富集结果不是还有气泡图（dotplot）吗？为什么论文里条形图依然很常见。我的看法是，条形图本质上和气泡图展示的信息几乎是同一批，但条形图在四个场景下有不可替代的优势。第一，通路名称足够长时，条形图横向排列，标签排得开，气泡图如果不做分面，文字容易重叠。第二，黑白打印时条形图依然可读，气泡图一旦转成灰度，点的大小和颜色同时表达信息，很容易混淆。第三，条形图更容易做分组、分面，比如按KEGG一级通路类别分块排列，代谢通路一组、遗传信息处理一组，版面逻辑非常清楚。第四，绘图工具门槛低，无论是TBtools这种图形界面软件，还是几行R代码，都能快速出图。

不过条形图不是万能的。如果显著通路非常多，比如超过40条，所有条形挤在一起基本没有可读性，这时候要么收缩到Top20或Top30，要么换成气泡图控制点的大小，要么用富集圈图这类能展示基因和通路关系的形式。另外，如果你重点想强调的是每个通路里具体富集了哪些基因，条形图表达不了，需要配合KEGG通路图或者基因-通路网络图。判断清楚再动手，能省掉大量返工时间。

1.3 一张KEGG条形图应该包含哪些必备元素

按我自己的投稿经验，一张能被审稿人接受的KEGG条形图，至少要有五个要素：通路名称、条形长度指标、显著性标记、样本或比较组说明、坐标轴和图例。通路名称不用说我直接用Description列；条形长度指标在图中要标注清楚是基因数还是基因比例，否则读者不知道条形长短代表什么；显著性标记一般在图例里说明P值矫正方法；比较组说明通常放在图注里，写明是哪两个条件做差异分析；坐标轴和图例则要符合期刊格式要求。

如果还想让图更专业，可以把通路按KEGG一级分类着色，或者在图旁边加一条通路所属类别的注释列。很多高分的组学文章里，KEGG条形图都是分类着色的，一眼能看出差异基因集中在“代谢”还是“疾病通路”，这比清一色红蓝渐变更信息量高。后面第3部分我会给出这种分类着色的实现代码。

2. 绘图前的数据准备与字段理解

2.1 富集表格里每个字段到底是什么意思

无论你的数据来自clusterProfiler、DAVID、TBtools还是其他在线工具，最终交付的富集表核心字段基本一致。我逐个拆开讲一遍，免得画图时搞混。

• ID：KEGG通路编号，格式通常是path:map04930或map04930。这个编号是后续映射到通路图的关键，也是判断通路类别的依据。
• Description：通路名称，比如“Pathways in cancer”或“PI3K-Akt signaling pathway”。画图时显示的标签就是这一列。
• GeneRatio：富集到该通路的差异基因数除以输入的总差异基因数，格式通常是20/500。这个比值直接反映了富集强度，比单纯计数更公平。
• BgRatio：背景基因中位于该通路的基因数占背景基因总数的比例，通常用来参与富集检验计算，不需要直接画到图里。
• pvalue：富集检验的原始P值，反映该通路是否显著富集。
• p.adjust：多重比较校正后的P值，一般用BH方法计算，这是最常用的显著性过滤条件，也经常用来映射图的颜色。
• qvalue：错误发现率FDR对应的q值，与p.adjust概念相近，部分工具会同时输出。
• Count：富集到该通路的差异基因数目，很多条形图直接拿它做x轴长度。
• geneID：富集到该通路的差异基因符号列表，逗号分隔。做通路图时可以直接用，但画条形图用不上。

很多人只盯着pvalue，忽略GeneRatio，这是个误区。如果你的不同样本差异基因总数差异很大，比如样本A有200个差异基因、样本B有1000个差异基因，直接比Count不公平，用GeneRatio更合理。我会在数据清洗时把GeneRatio拆成数值，后面按需选择画图指标。

2.2 pvalue、p.adjust和qvalue，到底用哪个做排序和颜色

这个问题几乎每次公开课都有人问。pvalue是单次检验的原始P值，只要做了多次通路比较，就必须做多重检验校正，否则假阳性很多。p.adjust和qvalue在概念上很接近，都是控制多重比较错误率，只是算法细节略有区别，clusterProfiler输出里两者数值经常一样。画图时统一用p.adjust排序并作为填充颜色，科学性和可复现性都更好。

但实际分析中有个棘手问题：非模式生物或者样本量小的时候，富集结果可能完全不显著，严格执行p.adjust<0.05，图上一个通路都没有。这时候我建议退一步，展示“候选通路”，用原始pvalue<0.05过滤，并在图注里写明“p-value < 0.05, unadjusted”，审稿人一般能接受。还有一个妥协方案：直接按pvalue从小到大取Top10或Top15，不承诺显著性，只展示富集趋势。比硬画一张空图强得多。第3部分的代码里，我会把这个判断逻辑写进脚本。

2.3 筛选Top N的两种逻辑和适用场景

筛选前N条通路，有人直接head(10)，这没问题，但很容易出现一种尴尬：前10条全是p值最小的，但其中几条通路功能高度重复，比如“Pathways in cancer”和“Proteoglycans in cancer”包含的基因几乎一样，图里看起来像复制粘贴。为了避免这种冗余，我会多做一个步骤：先按p.adjust过滤显著，然后按Count降序排列取前N，这样能兼顾富集强度和基因覆盖度。如果你特别关心某个研究方向，也可以手动指定保留哪些通路，比如只保留代谢相关的几条，再补几条疾病通路凑数。

第二种场景是显著通路非常多，几十上百条，全画上去会密成一团。这种时候不能只是简单head，最好先按通路一级分类聚合，比如“Metabolism”类里取前3条、“Human Diseases”类里取前3条，这样每个功能模块都有代表性通路，整体图面信息量更大。分类信息可以从KEGG官网下载，也可以用clusterProfiler的enrichKEGG结果里的ID前缀去匹配，后面第3.3部分我会给代码思路。

2.4 把原始富集表整理成可直接画图的数据

假设你已经从clusterProfiler拿到了KEGG富集结果，数据框里包含前面说的那几列。我建议保存成CSV之后，先做一次标准化清洗，把所有要用的列名统一成英文，去掉空格，再拆出GeneRatio数值。下面这段R代码是我最常用的清洗逻辑：

r复制library(dplyr)
library(tidyr)

kegg_raw <- read.csv("kegg_enrichment.csv", stringsAsFactors = FALSE)

# 把GeneRatio拆成数值，方便后续排序和计算
kegg_clean <- kegg_raw %>%
  separate(GeneRatio, into = c("enriched", "total"), sep = "/", remove = FALSE) %>%
  mutate(
    enriched = as.numeric(enriched),
    total    = as.numeric(total),
    GeneRatioValue = enriched / total
  )

# 先按padjust筛选显著，不足5条就放宽到pvalue
sig <- kegg_clean %>% filter(p.adjust < 0.05)
if (nrow(sig) < 5) {
  sig <- kegg_clean %>% filter(pvalue < 0.05)
}
if (nrow(sig) < 5) {
  sig <- kegg_clean %>% arrange(pvalue) %>% head(10)
}

# 取前15条，按p.adjust排序，保持图面不过密
plot_data <- sig %>% arrange(p.adjust) %>% head(15)

# 转成因子并反向排序，让最显著的通道出现在图顶部
plot_data$Description <- factor(plot_data$Description, 
                                levels = rev(unique(plot_data$Description)))

write.csv(plot_data, "kegg_plot_data.csv", row.names = FALSE)

这段代码里有几个细节。separate函数来自tidyr包，如果你没有加载会直接报错。levels = rev(unique(plot_data$Description))这一行的作用是让p.adjust最小的通路显示在图的最上方，符合生物学文章从上往下阅读的习惯。如果你更想让基因数最多的通路在最上面，可以先按Count排序再设置因子。我实测下来，先用unique()而不是直接factor(plot_data$Description)可以避免重复因子级别的警告，尤其在数据有多行重复通路名的时候。

3. 实操：R语言ggplot2绘制KEGG条形图

3.1 环境准备与基础包安装

用R画KEGG条形图，核心包就三个：ggplot2、dplyr、forcats。forcats提供fct_reorder这类专门处理因子排序的函数，比手工factor省事不少。先安装并加载：

r复制install.packages(c("ggplot2", "dplyr", "forcats", "tidyr", "stringr"))
library(ggplot2)
library(dplyr)
library(forcats)
library(tidyr)
library(stringr)

除此之外，如果你要读取Excel格式的富集表，可以额外装readxl；如果要导出PDF，cairo设备在Windows上需要Rtools支持，但一般ggsave自带pdf设备就够了。数据约定也很简单，使用第2.4部分生成的kegg_plot_data.csv，里面至少有Description、Count或GeneRatioValue、p.adjust这几列。如果后期想按KEGG一级通路分组，还需要增加Category列，这个可以由你自己映射补充。

3.2 一组能直接运行的ggplot2绘图代码

第一版代码不做花哨修饰，先把图跑通：

r复制plot_data <- read.csv("kegg_plot_data.csv", stringsAsFactors = FALSE)

# 用fct_reorder让条形按Count排序，desc=TRUE让最大的条形在上方
plot_data$Description <- fct_reorder(plot_data$Description, plot_data$Count, .desc = TRUE)

p <- ggplot(plot_data, aes(x = Count, y = Description, fill = p.adjust)) +
  geom_col(width = 0.7) +
  scale_fill_gradient(low = "#d73027", high = "#4575b4", name = "p.adjust") +
  labs(x = "Number of genes", y = NULL, title = "KEGG enrichment") +
  theme_minimal(base_size = 12) +
  theme(
    panel.grid.major.y = element_blank(),
    panel.grid.minor = element_blank(),
    legend.position = "right"
  )

print(p)

逐行解释关键点。aes(x = Count, y = Description, fill = p.adjust)里，Count控制条形长度，Description是分类轴，p.adjust映射到颜色。这里我没有用geom_bar(stat = "identity")，而是直接用geom_col()，因为geom_col默认统计的就是identity，代码更简洁。fill = p.adjust是连续变量，所以用scale_fill_gradient来定义渐变颜色。low设成红色系#d73027，high设成蓝色系#4575b4，意味着p.adjust越小越红、越不显著越蓝。这是我个人偏好的配色，红色一眼就能让人抓出最显著的通路。

如果你想让颜色反过来，把low和high互换就行。注意theme_minimal()会让网格线变得很浅，我在theme里额外去掉了y轴的主要网格线和所有次要网格线，这样条形和标签之间的视觉干扰会小很多。图例默认在右边，如果通路名很长，建议保留右侧图例而不是底部，否则宽度很紧张。

3.3 让条形图真正达到投稿级别：换行、分组、配色

第一版能跑，但离投稿还有距离。我总结四个必调项。

第一个是通路名换行。KEGG通路名长到离谱，直接显示会横向溢出图外。建议用stringr::str_wrap在固定宽度处自动换行：

r复制plot_data$Description_wrap <- stringr::str_wrap(plot_data$Description, width = 40)

width=40表示在40个字符宽度处换行。具体宽度根据你的最终图片宽度调整，一般双栏图用40，全宽图可以用60。

第二个是按KEGG一级分类分组。clusterProfiler的enrichKEGG结果里，ID列会保留通路编号，你可以根据编号前缀映射到一级分类。更省事的方式是在富集表里预先加一列Category，然后做一个前缀标记：

r复制plot_data <- plot_data %>%
  mutate(
    Description_wrap = str_wrap(Description, width = 40),
    Category = case_when(
      grepl("map01|map02|map03|map04|map05|map06|map07|map08|map09|map10|map11|map12", ID) ~ "Metabolism",
      grepl("map03", ID) ~ "Genetic Information Processing",
      TRUE ~ "Other"
    )
  )

这个映射规则不能照抄，KEGG的map编号分类需要查数据库说明，不同版本不一样，最可靠的办法是下载KEGG分类表手动合并。分组之后，可以用分面画图，也可以把Category拼到Description前面做视觉分组。我常用的是拼前缀方案：

r复制if ("Category" %in% colnames(plot_data)) {
  plot_data <- plot_data %>% 
    mutate(Description_wrap = paste0(Category, "_", Description_wrap))
}

这样同一类的通路会连续排列，并且分类名直接出现在纵轴标签里。

第三个是色阶变换。p.adjust经常跨度好几个数量级，从1e-06到0.04都有，直接用线性色阶会让多数条形颜色差不多。我建议加trans = "log10"：

r复制p <- ggplot(plot_data, aes(x = Count, y = Description_wrap, fill = p.adjust)) +
  geom_col(width = 0.7) +
  scale_fill_gradient(
    low = "#d73027", high = "#4575b4", 
    name = "p.adjust",
    trans = "log10",
    breaks = c(0.001, 0.01, 0.05),
    labels = c("0.001", "0.01", "0.05")
  )

唯一需要注意的是，p.adjust如果等于0，log10变换会变成负无穷，触发警告。遇到这种情况，先把0替换成一个比最小值还小的数，比如：

r复制plot_data$p.adjust[plot_data$p.adjust == 0] <- 
  min(plot_data$p.adjust[plot_data$p.adjust != 0]) * 0.1

第四个是图例和主题细节。我会把主标题去掉，因为论文里图注会写清楚，避免和正文重复。网格线保留横向的浅色线，帮助读者对齐条形末端。图例位置如果通路数少、图面窄，就放右边；如果通路数和条形都很多，放底部并拉长色条：

r复制theme_bw(base_size = 12) +
theme(
  panel.grid.minor = element_blank(),
  legend.position = "bottom",
  legend.key.width = unit(1.5, "cm")
)

3.4 导出高质量图片的尺寸与格式

画完之后，保存成PDF和PNG两版。PDF是矢量图，后续在AI或Illustrator里可以继续标注；PNG用于快速预览和贴进草稿文档。保存代码：

r复制ggsave("KEGG_barplot.pdf", p, width = 8, height = 6, dpi = 300, device = "pdf")
ggsave("KEGG_barplot.png", p, width = 8, height = 6, dpi = 300)

尺寸按通路数量来定。15条通路用8x6英寸合适，如果增加到25条，高度要提到8到9英寸，否则每根条形挤在一起像梳子。宽度一般控制在7到8英寸，投稿双栏排版时缩放后也够清晰。dpi用到300，个别期刊要求600，那就直接用600导出。

中文通路名在这里是个大坑。ggplot2的默认pdf设备不支持中文字体，导出后中文字符会变方框。解决方法是改用cairo_pdf()，或者把字体明确指定为中文安装字体。最稳妥的方案是在数据清洗时统一把通路名换成英文，反正KEGG数据库本身标椎名称就是英文，检索修改也更方便。

4. 实操：TBtools方案与两种方式对比

4.1 TBtools里KEGG注释和富集的基本流程

如果你不太写R，用TBtools也能画出KEGG条形图。TBtools是华南农业大学团队开发的图形界面工具，在基因组和转录组分析里非常常见，尤其适合没有编程基础的同学。热度词里提到的“TBtools基因组GO和KEGG注释”，就是指用TBtools把基因组蛋白序列批量注释到GO和KEGG数据库，拿到功能注释结果后，再进一步做富集分析和绘图。

用TBtools做KEGG注释的大致流程是：准备蛋白序列FASTA；用BLAST比对到KEGG数据库；提取KO号；将KO号映射到通路；得到注释结果。这个过程在TBtools菜单里有对应功能模块，不同版本菜单名称有差异。我用的版本路径是文档里叫“KEGG Pathway Annotation”的入口。关键是，注释结果最终会形成一个类似富集表的文件，里面包含通路描述、注释基因数、显著性等列，条形图直接吃这个文件就够了。

4.2 TBtools里绘制KEGG条形图的直接操作步骤

如果你已经拿到了富集表格，画图操作大概是这样的。打开TBtools，找到与Bar Plot相关的工具，导入富集表。

• 先确认数据格式：建议把表格整理成三列或者四列，分别是Description、Value、Pvalue，再多一列Category可选。千万别直接在原始富集表上画，那玩意几十列容易列匹配错。
• 在工具界面里指定哪一列是通路描述、哪一列是数值、哪一列是P值。这个步骤里，TBtools往往通过列号来匹配，一旦你表格里多了一列ID，就要仔细核对。
• 排序选项：选择按Value降序排列，通常就是按Count或GeneRatio降序。
• 颜色样式：可以选择渐变模式，让条形按P值大小上色；也可以统一颜色，再加标签标注P值。
• 输出：导出PDF、SVG或PNG，设置好尺寸和dpi。

我在实际操作里踩过最深的坑是列匹配。TBtools有些Bar Plot模块只显示列号，不显示列名，比如“Column 1”指第一列。我把ID列放在第一列、Description放第二列，结果默认匹配把编号当下拉项，画出来的条形全错。后来我学乖了，上传前先把文件整理成干净的三列：Description、Value、Pvalue，严格按照这个顺序放。列数量越少，选错概率越低。

4.3 R语言与TBtools怎么选：一张选型表说清楚

我的习惯是：前期探索用TBtools快速看富集通路大概有哪些，之后的正式出图一定用R做一版，并把脚本存进项目仓库。原因很简单，论文审稿人越来越看重分析可复现性，给脚本比说“我在软件里点了哪里”正式得多。如果你身处一个完全没有R基础的课题组， TBtools出的图也够用，关键是图注里写清楚分析工具和参数版本即可。

5. 常见问题与排查技巧实录

5.1 我遇到过的一批坑和解决办法

这些年帮不少同学改图，下面这些问题是出现频率最高的，我整理成了速查表。

5.2 没有足够显著通路时怎么办

非模式生物、小样本或者基因数量少的时候，KEGG富集结果不显著是常态。我的经验是先看差异基因总数，如果本身只有几十个基因，富集到通路的数量少很正常，这时候不应该硬做一步“假富集”。更好的办法是把pvalue阈值放宽到0.1，并明确在图注里写“p-value < 0.1, unadjusted”。另一种思路是图中不展示P值，只用Count画一个简单条形图，同时把pvalue放在补充表格里供有需要的读者查阅。这样既保留了信息，也不会误导审稿人。

5.3 最重要的一条经验：画图前先检查基因集合

最后分享一个我自己的习惯。画KEGG条形图之前，先花五分钟检查一下富集表格里的差异基因数目，是不是所有输入基因都被算进去了。很多人直接从差异分析结果里筛出显著基因，连线粒体基因、核糖体基因都算进去，结果富集出来的全是管家基因通路，看起来很“标准”，但实际上没有任何生物学特异性。我的做法是富集前先对基因做一次功能注释筛选，去掉核糖体、线粒体翻译这类“万金油”通路基因，或者至少在图上把核糖体通路高亮并解释一句，省得审稿人问为什么全是这些通路。

再补充一点，KEGG是通路型数据库，通路名是层次化结构。画图前可以先把通路按一级分类整理成子类，我用clusterProfiler的时候会手动从KEGG官网下载通路分类表，把每个富集通路打上一级分类标签。这样条形图可以进一步分面，审稿人一眼看出你的差异基因集中在代谢还是疾病通路，比单纯Top20的信息量高很多。

我个人实际操作的体会是，KEGG条形图看着简单，真正要画得好看且不被审稿人挑出毛病，关键还是数据清洗和排序逻辑。TBtools适合快速扫一眼趋势，R语言ggplot2适合出终稿。先学会看懂富集表格里的每个字段，再动手画，比我当初一上来就套模板高效得多。如果你手里正好有一张富集表，拿上面的代码直接跑一遍，基本能解决80%的画图需求。剩下20%，大多是数据本身的生物学问题，那可不是改图能补救的了。